伯乐垂直电泳MP4设置和基本操作
作者:bioservicer           时间:2020-02-15 23:47:59

一  准备凝胶

手动凝胶

1:玻璃盒和制胶架装配注意:所有玻璃板应清洁干燥

a.将制胶架竖直放置,压力凸轮处于打开位置,并面向前方,放置在平面上。

b. 选择一个所需凝胶厚度的间隔板,并在其顶部放置一个短板(见图3a)。

c. 定位间隔板,使标签向上。 将两块玻璃板滑入制胶架,使短板面向机架的前部(有压力凸轮的一侧)(见图3b)。

注意:确保两个板在水平面上齐平,并且间隔板上的标签正确定向。 如果板不对齐或方向不正确,可能会发生泄漏。

d. 当玻璃板就位时,接合压力凸轮以将玻璃盒夹层固定在铸造框架中(见图3c)。检查两个板的底部是否齐平。

e. 通过将铸造框架(锁定的压力凸轮朝外)定位到铸造垫圈上,同时将铸造支架的弹簧加载杆接合到间隔板上,将铸造框架放入铸造支架中(见图3D)。

注:灰铸铁支架垫圈必须清洁干燥。 铸造支架垫圈由一种特殊的热塑性材料制成,当浸入水中时会膨胀,因此我们建议您在铸造之前不要长时间浸泡垫圈。 如果垫圈不小心被浸湿,并显示出膨胀和/或变形,只需让它们风干,它们就会恢复原来的形状,尺寸和性能。

f. 对于额外的凝胶,重复步骤a-e。

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图3小型制胶架与制胶框装配图

 

2 凝胶

a.     间断聚丙烯酰胺凝胶

i.将梳子完全放入组装好的凝胶盒中。 在梳齿下方1厘米处标记玻璃板。 这是溶解凝胶被浇注

到的水平。 取下梳子。

ii通过合并除APS和TEMED以外的所有试剂来制备分解凝胶单体溶液。 (关于凝胶配方,参见第4节。) 将溶液在真空下脱气至少15分钟。 不要使用水槽吸水器。

iii 向脱气单体溶液中加入APS和TEMED,用玻璃或一次性塑料吸管倒入标记处。 平稳地倒入溶液,防止它与空气混合。

iv立即用水或叔戊醇覆盖单体溶液。

注意:如果用水,要缓慢均匀地加入,防止混合。 不要用丁醇或异丁醇覆

v使凝胶聚合45分钟至1小时。 冲洗凝胶表面完全用蒸馏水处理。 不要将酒精覆盖物留在凝胶上超过1小时,因为它会使凝胶的顶部脱水。

注意:此时,分解凝胶可在室温下保存过夜。 向分解凝胶中加入5毫升1:4稀释的1.5M Tris-HCl,pH8.8缓冲液(对于Laemmli系统)以保持其水合。 如果使用另一个缓冲系统,则添加51毫升1x分离凝胶缓冲液,用于储存。

vi制备堆叠凝胶单体溶液。 合并除APS和TEMED外的所有试剂。 在真空下脱气至少15分钟.

vii在倒入堆积凝胶之前,用滤纸将分解凝胶的顶部干燥.

viii向去除的堆积凝胶单体溶液中加入APS和TEMED,并将溶液倒入玻璃板之间。 继续倒灌,直至短板顶部。

b.连续聚丙烯酰胺凝胶

i混合所有试剂制备单体溶液

除了APS和TEMED。 真空脱气15分钟(关于凝胶配方,参见第4节)。

ii向脱气单体溶液中加入APS和TEMED,并将溶液倒入玻璃板之间。 继续倒灌,直至短板顶部。

iii将所需梳状物插入间隔垫片之间,从间隔垫片顶部开始,确保每个梳状物末端的凸舌在间隔垫片之间被引导。 将梳子脊与短板顶部对齐,将梳子安置在凝胶盒中。

Iv使用后用去离子水冲洗灌胶框架等附件。

Ready Gel®预制凝胶

1现成凝胶盒制备

注:Mini-PROTEAN Tetra电泳槽保证与Bio-Rad的Ready凝胶和Mini-PROTEAN®precast凝胶一起使用。

a从储藏袋中取出备用凝胶

b轻轻地取下梳子,用蒸馏水或流动缓冲液彻底冲洗每个孔。

c用剃刀片沿备用凝胶盒底部的虚线切割。

d拉动备用凝胶盒底部的透明胶带,露出凝胶底边。

e:重复第二次准备凝胶。

注意:如果只运行一个或三个凝胶,使用塑料胶板。如有问题咨询天津伯乐biorad仪器维修中心

 

电泳模块组装及上样所需材料

------清洁干燥的微型Tetra电泳槽

------电泳模块(电极组件模块仅用于1或2种凝胶;对于3或4种凝胶,还使用配套运行模块)

-------运行缓冲液(2种凝胶700毫升;4种凝胶1000毫升)

-------预制凝胶或手工浇铸凝胶

-------PowerPAC™基本电源

1装配

注意:当只运行2个凝胶时,使用电极组件(带香蕉头的),而不是配套运行模块(不带香蕉头的)。 当运行4个凝胶时,必须同时使用电极组件和配套运行模块,共运行4个凝胶(每个组件2个凝胶)

a将夹紧框架设置在清洁平坦表面上的打开位置(见图4a)。

b将第一个凝胶夹层或凝胶盒(短板朝内)放置在凝胶支架上; 在夹架组件的底部模塑凝胶支架; 总成的每一侧都有两个支架。 请注意,凝胶现在将以30°角静止,从夹紧框架的中心倾斜。放置第一个凝胶时请小心,确保夹紧框架保持平衡,不会倾斜。 现在,把第二个凝胶放在另一面。夹紧框架,再次将凝胶放置在支架上。 在这一点上,将有两个凝胶以一个角度静止,一个在夹紧框架的两侧,倾斜离开框架的中心(见图4b)。注意:凝胶盒放入夹紧架时,短板朝内,这是很关键的。 此外,夹紧框架需要2个凝胶来创建一个功能良好的组件。 如果正在运行奇数个凝胶(1或3),则必须使用缓冲坝(参见图4b)

c用一只手轻轻地将两种凝胶相互拉向对方,确保它们牢固地,直立地靠在夹紧框架内的绿色垫圈上; 确保短板刚好位于绿色垫圈顶部的缺口下方。

d当用一只手轻轻地将凝胶三明治或盒挤压到生坯垫圈上时(保持恒定的压力并使两个凝胶牢固地固定在适当位置),将夹紧框架的生坯臂滑动到凝胶上,将它们锁定在适当位置。 或者,您可以选择用双手拿起整个组件,确保凝胶不移位,同时将夹紧框架的两个臂滑动到位(见图4c)。

夹紧框架的臂将每个凝胶盒的短板推到绿色垫圈的缺口上,形成防漏密封(再次检查,确保短板正好位于绿色垫圈顶部缺口的下方)。 此时,可以用流动缓冲液冲洗样品井,并装载样品(图4d)。

注意:如果运行两个以上的凝胶,重复步骤1a-d与配套运行模块

重要提示:在未确保凝胶盒完全对准并稳定在模块的绿色垫圈上的凹口之前,请勿试图锁定夹紧框架的绿色臂。 为防止凝胶在锁止步骤中移位,请用一只手将凝胶准确,均匀地夹在模块芯上。

警告:当只运行1或2个凝胶时,不要将辅助运行模块放置在罐中。 这样做会造成发热过大,阻止电泳分离。

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图4   组装Mini-PROTEAN Tetra小型电泳模块

 

2样品装载

a在组件(上腔室)中填充缓冲液,刚好位于外凝胶板边缘下方。

b当样品放置在槽外的平坦表面上时,将样品装入每个组件中。

c用Hamilton注射器或使用凝胶加载尖端的移液管将样品加载到凝胶孔中。

d如果使用Bio-Rad的专利样品加载指南,将其置于电极组件的两种凝胶之间。样例加载指南可用于9、10、12和15孔格式。

e使用样品装载指南定位样品槽。 将Hamilton注射器或移液管尖端插入导轨的槽中,并填充相应的孔。

注意:缓慢装载样品,让它们均匀地沉降在孔底。 注意不要用注射器针头或移液管刺破孔底。

3 将电极组件装入电泳槽内

注:在将模块放入罐内之前,可先将样品装入模块内。 在模块被放入罐中之后,样品也可以被装载到模块中。 这两种方法都将产生可接受的结果。 在这两种情况下,组件(上室)和储罐(下室)填充缓冲液。

注:所需缓冲液总容量,2个凝胶700毫升; 1000毫升用于4种凝胶。

Mini-PROTEAN Tetra水箱有两个放置两个组件的位置:电极组件(后部位置)和配套运行模块(前部位置)。

a.     首先将油箱放置在fl表面,油箱正面对着您(油箱正面是具有2-凝胶和4-凝胶线标记的面); 当正确定位时,坦克顶部内侧边缘的红色标记将在您的右侧,坦克顶部内侧边缘的黑色标记将在您的左侧。

b.    如果只运行2种凝胶,您将只使用电极组件,因此将该组件放置在电泳槽的后面位置,确保红色(+)电极插孔与罐右上内侧边缘的红色标记相匹配。

c.     如果运行4个凝胶,将电极组件(香蕉头)放置在后面的位置而同伴运行模块(没有香蕉插头)在前面的位置。 确保在这两种情况下,红色(+)电极与罐内右边缘顶部的红色标记相匹配。 注意,不正确的方向将不允许正确放置盖子。

d.    用缓冲液填充罐(下腔室)至指示液位(2种凝胶550毫升,4种凝胶680毫升)。

4 电泳槽组装

a将盖子盖在Mini-PROTEAN Tetra电泳槽上。 确保对齐有颜色编码的香蕉插头和插孔。 将盖子上的插孔与电极组件上的香蕉插头相匹配,就可以获得正确的方位。 盖上的止动件可防止方向不正确。 请注意,槽子两侧的凸起塑料片穿过盖子,引导盖子正确关闭。 在这一点上,坚定地,但轻轻地,用你的拇指按下盖子,使用均匀的压力盖子牢固而紧密地放置在槽上。

警告:当只运行1或2个凝胶时,不要将辅助运行模块放置在罐中。 这样做会引起过度发热,并会阻止电泳分离。

5电源条件

a将导线插入具有适当极性的适当电源中。

b向小型电泳槽通电并开始电泳; 对于SDS-PAGE和大多数原生凝胶应用,推荐使用200 V常数。 2和4凝胶使用相同的电压(200 V)。 应用程序的最佳电压可能不同。 SDS-PAGE在200 V下的运行时间约为35分钟。

对于Tris-HCl凝胶,电泳时间将在35到45分钟之间变化,这取决于丙烯酰胺的百分比水平。

6 剥离凝胶

a电泳完成后,关闭电源,断开电引线。

b拆下油箱盖并小心地提起电极总成。 倒出并丢弃正在运行的缓冲区。

注意:在打开总成臂之前,务必将缓冲液倒掉,以避免缓冲液溢出。

c打开组件的臂,并拆下凝胶盒。

d轻轻地分离凝胶盒的两个板,从凝胶盒中取出凝胶。

注意:要从备用凝胶盒中取出凝胶,首先将胶带沿备用凝胶盒内玻璃板与外塑料板相接处的侧面切成薄片。

e在固定液或转移液的作用下,将凝胶和平板倒置,将凝胶从平板上移出,轻轻搅拌直至凝胶从平板上分离。

f使用后用蒸馏水和去离子水清洗微型protean Tetra电泳槽电极组件、夹紧框架和槽子。



作者:天津伯乐biorad仪器售后维修中心

                                                                                                                                                                                              2020.2.15                                                                                                                                                                                                          






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